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Descoberta de marcadores moleculares para determinação da origem geográfica do nemátode-da-madeira-do-pinheiro

caso3.pngBursaphelenchus xylophilus é o nemátode causador da doença da murchidão do pinheiro. O foco inicial da doença ocorreu em Setúbal em 1999 e, apesar das medidas de contenção, espalhou-se ao país inteiro. O nemátode é originário dos Estados Unidos, pensa-se que foi difundido para a Ásia e daí para Portugal. O nemátode é introduzido nas árvores quando o inseto vetor, do género Monochamus, se alimenta dos ramos jovens. Uma vez dentro do pinheiro, reproduz-se no xilema, causando cavitação dos vasos, interrupção da passagem de água e murchidão.

Recorrendo a tecnologias de sequenciação de última geração, sequenciámos o transcriptoma de sete isolados de quatro regiões distintas: quatro isolados portugueses, um isolado chinês, um isolado japonês e um isolado dos Estados Unidos. A comparação das sequências dos transcritos para genes de patogenicidade e de outras vias, nomeadamente celulases, liases de pectato, expansinas e proteínas alergénicas, proteínas envolvidas na ubiquitinação e quitinase, envolvida na alimentação a partir de fungos, revelou a presença de 136 SNPs.

A validação destes SNPs efetuou-se nos genes correspondentes, ao nível do DNA, num conjunto alargado de isolados. Os SNPs foram utilizados para aferir a distância genética entre os vários isolados, análise que revelou a distância dos isolados portugueses dos isolados americanos e japoneses, a proximidade com os isolados chineses e a similitude com um isolado coreano. Entre os SNPs encontrados foi possível selecionar um conjunto de cinco SNPs com capacidade para discriminar os quatro locais de origem. Para a deteção expedita destes SNPs diferenciadores foi desenvolvido um kit de identificação, baseado em PCR em tempo real, que permite determinar a origem geográfica do nemátode, de forma rápida e com elevada sensibilidade.

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